血友病研究的进展

血友病研究的进展

血友病是由于遗传性凝血因子VIII（FVIII）和IX（FIX）基因缺陷，造成血浆FVIII和FIX含量不足或功能缺陷，引起的一组终生出血的凝血障碍性疾病，包括血友病A（FVIII缺乏）和血友病B（FIX缺乏），属X性联隐性遗传性疾病。西方国家血友病患病率为5-10/10万人口，我国2.73/10万人口。自70年代以来，随着有效的替代治疗，血友病致残率与死亡率大大降低，发达国家血友病患者的寿命已从50年代的平均10岁提高到接近正常水平。80年代后，随着病毒灭活技术的不断改进，替代治疗的安全性得到保障，血友病患者感染病毒性肝炎，爱滋病大大降低。进入90年代以来，重组凝血因子的广泛应用，不仅提高疗效，同时避免了传统人源性凝血因子应用后产生抗体与易发生病毒感染的副作用。基因治疗在动物试验中获得成功,在人类的临床初步研究成果为血友病的根治带来曙光。如何进一步降低血友病患者的死亡率，致残率，出生率，提高患者生存质量是目前工作的重要任务。本文仅就血友病近年研究进展进行概述。
一．发病机制的研究
FVIII基因定位于Xq28，全长186kb，由26个外显子和25个内含子组成。已发现约300多种基因突变，基因型与表型密切相关。点突变，小的基因缺失引起轻度FVIII缺乏。终止密码子，大的基因缺失，插入，移位，无义突变往往引起严重的FVIII缺乏和临床表型。已证实FVIII 22内含子倒位突变引起FVIII严重缺乏是45%的重型血友病A的分子发病机制。最近在1%的重型血友病A中还发现FVIII内含子1倒位突变。
二．基因诊断：确定致病基因；用于携带者检出和产前诊断；并可预测抑制物的产生。
（一）直接基因诊断：采用分子生物学方法(PCR，DGGE，SSCP，DNA测序等)直接测定致病基因的缺陷。FVIII 22内含子倒位分析可作为重型HA的筛选试验，也是目前唯一用于临床诊断的直接基因检测方法。FVIII 22内含子倒位和其它一些基因突变常伴有抑制物发生，因此有助于预测抑制物的产生。
（二）间接基因诊断：利用致病基因内外的限制性片段长度多态性（RFLP）作为特异分子遗传标志物，通过家系成员间的连锁关系确定血友病基因的遗传情况，进行DNA多态性分析的遗传学诊断(RFLP，VNTR，STR等方法)，可使诊断率达99%。RFLP分析的局限性：必须具有先证者的标本；母亲系该多态位点的杂合子，联合多个RFLP才可诊断。
（三）产前诊断：对高危胎儿可在妊9-12周通过绒毛膜活检；妊12-16周进行养水穿刺，近来还可在胚胎植入前通过早期胚胎（8个细胞时）获取胎儿DNA，通过DNA基因型和遗传表型确定胎儿性别，以及进一步判断是否为血友病或携带者。妊18-20周可在胎儿镜下取脐静脉血，测定FVIII:C和FVIII:Ag。上述方法都存在流产的危险（约0.5%-1%）, 需在妇产科医生的指导与配合下进行。利用流式细胞术（FACS）测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别，提供了早期，无创性产前诊断的方法。
三．替代治疗：是目前最有效的治疗手段。主张尽早治疗，将凝血因子提高到止血水平，避免出血并发征，防止功能丧失。但目前全世界尚有80%患者没有任何替代治疗。血浆制品的产率仅5%-10%，随血源紧张将越来越匮乏与昂贵。
（一）人FVIII浓缩物：近15年随着病毒灭活技术的改进（干热法-HIV，有机溶剂加表面活性剂方法-HCV，二步病毒灭活法-HAV），血浆筛选的规范化（PCR），血制品的安全性大大提高，血源传播性疾病如肝炎，爱滋病发生率明显降低。
中纯度：含FVIII 1-3U/mg，每1U/kg可使血浆FVIII水平提高2%，含VWF，也可用于VWD治疗。体内半寿期为8-12小时。副作用：病毒感染，抗FVIII抑制物产生。
高浓度：含FVIII 50-200U/mg，利用层析技术制备，不含VWF。
超高纯度：含FVIII 3000U/mg，利用离子交换层析或单克隆抗体技术制备，不含VWF，
主要用于FVIII抑制物(中高滴度, 10-30BU)的治疗。
（二）重组FVIII浓缩物（rFVIII）：通过基因克隆技术表达，1990年通过美国FDA批准，其生物活性，半寿期与血浆FVIII相似，安全，无病毒污染。但价格昂贵，也可产生抗体。目前在加拿大与爱尔兰几乎所有血友病患者，美国70%以上重型HA采用rFVIII治疗。主要用于重型血友病A和抑制物的治疗。
第一代rFVIII（全长FVIII）：利用人体白蛋白作为稳定剂。
第二代rFVIII（BDD）：利用蔗糖代替蛋白作为稳定剂，FVIII无B区，但仍保留其活性，生化特性基本同血浆制品。由于不含其他人类蛋白，无免疫活性，更安全，有效。使用BDD时，一期法FVIII：C测定低于正常50%，推荐二期法或发色底物法可得理想结果。
第三代rFVIII：利用鼠单抗，不含人和动物蛋白，尚处临床试验阶段。未来若干年内，转基因方法生产的人血浆制品的产量将大幅度提高，有望满足全世界血友病患者的需要。
（三）猪FVIII浓缩物：多数抑制物对猪FⅧ的亲和性比对人FⅧ亲和性差，不易与人FⅧ抗体发生交叉反应,，用于高反应型抑制物且严重出血患者的治疗。付作用：轻度发热，皮疹，血小板减少（5%-10%），多与剂量有关，偶尔有变态反应，未经病毒灭活。猪与人FⅧ有交叉免疫性，约30%产生抗猪FⅧ抗体，造成耐药。强调开始足量，迅速降低抗体，抗体滴度<5BU：50u/kg；5-30BU：75-100u/kg；>30U：100-150u/kg 。最近重组的猪FVIII进入一期临床试验：重组人-猪FⅧ混合物利用抗原性较弱的无B区的猪FVIII序列替代人FVIII A2，活化的肽-A3和C2序列，以降低免疫原性与抗原性，可望成为治疗抑制物的新制剂。
（四）FVIII旁路制剂-不依赖FVIII/FIX的止血的制剂
其作用原理是绕开内源性凝血途径，通过补充外源或共同凝血途径中所需的凝血因子同样可达到凝血终点。
（1）凝血酶原复合物(PCC)：含FII，FIX，FX和FVII，主要用于血友病B的治疗。PCC (无肝素)还被作为“旁路制剂”广泛用于产生FVIII抑制物患者出血的治疗，75-125U/kg/次，有效率50-60%。可引起血栓，长期制动如术后患者不主张用。1974年国际血栓与止血委员会建议每ml PCC中加入5-10U肝素以防止血栓。
（2）激活的凝血酶原复合物(APCC)：含一定量的“FⅧ抑制物旁路活性“（Factor eight inhibitor bypassing activity，FEIBA）的PCC（亦称抗抑制物凝血复合物），已有两种产品Autoplex”(Batex hyland) 50U/kg和FEIBA(Immuno)，50-75U/kg，q8-12h。用于产生抑制物的血友病A出血的治疗，有效率达40%-60%。副作用：血栓发生率为1%-2%，反复大量使用，肝脏病，抗凝血酶缺乏时易发生，如使用3-4次后无效，则不应再用。
（1） 重组激活的FVIIa (rVIIa)：一种新的“旁路制剂”，通过直接或与受损部位的组织
因子结合成复合物，与暴露在激活的血小板表面带负电荷的磷脂结合后，直接激活FXa；同时还可激活FIX成为FIXa，促进凝血酶形成，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，达到局部止血。这种酶促反应局限在细胞表面，可能降低了全身凝血活化和血栓并发症的危险。推荐剂量为90ug-120ugkg-1，静脉注射，q2-3h, 重复2-4次（rVIIa 半寿期仅2-3小时），直至止血。rVIIa治疗有抑制物的患者的自发性出血或预防大手术的严重出血有效率达80%-90%，还可用于无抑制物HA，HB患者及伴有FIX抑制物者，遗传性FVII缺乏者出血的治疗，一般剂量为35- 70u/kg/次，有效率达80%。rVIIa使用安全，一般无需实验室监测。注射局部可形成血栓性静脉炎，极少发生血栓与DIC，但已有心肌梗死的报道。禁忌：已知对rVIIa和鼠，牛蛋白过敏者。缺点：价格昂贵。
五．其它治疗：
（一）DDAVP (弥凝 Stimate)：是一种血管加压素的衍生物(1-精氨酸-8-血管加压素)，介导FVIII，VWF，纤溶酶原激活物从内皮细胞迅速释放到循环中，释放的VWF结合FVIII，使FVIII静脉注射后增高约2-3倍。重复用药至少应间隔24小时以上，因为储存需要再充实。最早用于20世纪70年代末，80年代HIV流行时在意大利被广泛应用，可避免应用生物制剂病毒感染，抗体产生。剂量：0.3-0.4ug/kg+30ml生理盐水， 15-30分钟输完，也可鼻饲。副作用：很轻且短暂，如注射中面色发红，心率加快，轻度头痛，鼻塞。水潴留很少见，
适应征：轻型血友病A，血友病携带者和1型VWD首选。中，重型HA和2型VWD无效。禁忌征：2B型和假性VWD，由于大的VWF多聚体的突然释放，与血小板亲合力增加而引起血小板聚集性增高，或血小板与大的多聚体的结合引起血小板减少。心绞痛，心衰，妊娠禁用。5岁以下儿童慎用。
（二）早期慢性滑膜炎的非手术治疗：经验来自同位素治疗风湿性关节炎。采用32P关节腔内注射，利用射线“切除”增殖的滑膜和血管，可减少关节出血率，促进功能恢复。成功率约80%，疗效接近关节镜滑膜切除，简单，安全，只需少量替代治疗。适应征：慢性血友病滑膜炎，关节反复出血，6个月内出血超过3次，无明显关节软骨及骨质破坏，关节功能I-II级，替代治疗效果不佳的血友病患者。5岁以下儿童慎用。
（三) 血友病的继发性疾病
病毒感染并发症：1985年以前，多数接受浓缩物治疗的血友病患者感染HIV，乙肝（HBV），丙肝病毒（HCV），直至近几年献血员筛选及病毒灭活得到改善。
1． 肝脏病变：HCV，HBV感染发展成慢性活动性肝炎，慢性迁延性肝炎（50%），肝硬
化（10%-20%），肝癌发生率高于一般人群30倍。肝功能衰竭已成为血友病患者死亡的不可忽视的原因之一。HCV治疗同非血友病患者的肝炎，α干扰素及病毒唑合用，约1/2获得长期缓解。国外对少数失代偿性肝硬化血友病患者进行肝移植，移植的肝脏产生一定的FVIII或FIX，因此血友病同时得到改善。少数患者HCV合并HIV感染，治疗棘手，死亡率大大增加。
2．获得性免疫缺陷病（AIDS）：1978-1985年，90%重型HA感染HIV，AIDS成为血友病死亡的主要原因（占65%）。HIV感染引起继发性免疫缺陷，卡波氏瘤增加200倍，非霍奇金淋巴瘤增加29倍。1985年以来，随着严格献血员筛选，病毒检测及病毒灭活技术（加热法，有机溶剂加表面活性剂，亲和层析法，二步法病毒灭活）的不断改进，现已基本消除感染HIV的危险，血制品的安全性与有效性得到大大提高。治疗同其它非血友病AIDS患者。
二．伴有抑制物血友病A的治疗：个体化，经验性治疗。
FⅧ抑制物是临床最常见的引起出血的凝血因子抑制物,1940年报告了首例获得性血友病。80年代以前，伴有抑制物的血友病患者治疗棘手，死亡率较高。目前随着FⅧ“旁路制剂”的应用，使患者的预后大大改观。
[抑制物产生的流行病学与危险因素]
HA患者接受含有FⅧ的血制品替代治疗后产生的特异性抑制或灭活FⅧ促凝活性的抗体，发生率占HA 20%-30%，95%的抑制物发生在中重型。抑制物产生的平均时间为暴露于抗原后50天内（中位数5-16天）。1/3抑制物为一过性，无临床意义。80%为高反应型。多发生于儿童（10岁以前）。有阳性家族史，某些种族（如非洲人种），免疫应答反应强者发生抑制物危险性较高。近年发现抑制物产生与基因关系密切，大片断基因缺失（约占30%），无义突变（约占25%）；22内含子基因倒位（约占20%-30%），终止密码子引起FⅧ蛋白缺失，抑制物的发生率占35%，而小的基因缺失，错义突变，剪切点突变致FⅧ蛋白存在,但活性丧失，这种抑制物的发生率仅占5%-10%。因此可见，基因突变类型可成为临床预测抑制物发生的危险因素之一。 较重要的突变往往缺乏FVIII抗原（CRM-），重型患者由于体内基本无FVIII蛋白（抗原）的合成与分泌，替代治疗采用的FVIII则成为异体蛋白（抗原），诱导免疫反应，产生同种免疫抗体。轻中型HA可合成和分泌无功能活性的FVIII蛋白，因此部分患者可形成免疫耐受，抗体发生率低（3%-13%）。但某些CRM+错义突变的轻中型HA也是抑制物产生的危险因素。引起稳定的FVIII分子异常的突变（如Cys残基可导致异常二硫化键形成）是抑制物产生的最危险因素。
根据抑制物免疫应答反应分为：低反应型-抗体滴度低（5BU/ml），反应慢，可一过性的，多在4-12周自行消失，再次暴露于抗原后并不升高，25%HA为此种类型。高反应型-抗体滴度高（5BU/ml），反应迅速，强烈，多有免疫记忆，再次暴露于抗原后（3-7天）抗体可显著升高，持续时间长，甚至达1-2年，占75%。总之，抗体产生机制复杂，尚未完全清楚，与治疗的强度，制剂有关。
非HA患者产生的FⅧ抑制物是一种自身抗体（或称自发性获得性FⅧ抑制物，获得性血友病），由于体内多种抗体与FⅧ有交叉反应性而产生，发生率为1/100万，可自行消失，多在60岁以后发病，50%伴有自身免疫性疾病（SLE，类风湿关节炎），此外药物(如青霉素，α-干扰素等)，恶性肿瘤，支气管哮喘，皮肤病，GVHD患者，妊娠或分娩后，甚至健康老人中也可产生。
[抑制物的免疫生物学特性]
FVIII抑制物属多克隆高亲和性的免疫球蛋白，多IgG（自身抗体大多为Ig1, Ig4），少数IgM， IgA或混合型。针对不同抗原决定簇，产生不同抗体。其合成依赖对FVIII特异的CD+4 T细胞的激活。通过多种免疫技术证实抗体结合部位主要在FⅧ轻链，抗C3抗体通过与重链分子上的A2区（残基373-740）或/和轻链上C2结构区（残基2173-2332）发生反应，阻止因子FⅧ与磷脂（磷脂酰丝氨酸）表面结合，影响FVIII活性；影响凝血酶对FⅧ的激活；干扰FⅧ与FIXa，FXa相互作用。抗A2抗体通过阻断内源性FXase/X复合物抑制FVIII功能；少数干扰FVIII与VWF的结合。同种抗体浓度与FVIII灭活呈线性关系，呈时间依赖性，且不会自行消失。而自身抗体则无此特点。某些IgG中和FVIII可能是由于其内源性蛋白水解活性。约68%患者血浆中测出抗A2，C2抗体；46%为结合AR3的抗体。
[临床表现]
一．HA患者- HA出血症状突然加重，频率增加，对以往治疗无效时应考虑抑制物的产生。
二．.自发获得性FⅧ抑制物- 非HA患者突然自发性出血，出血表现类似HA，可广泛皮肤淤班，肌肉出血，软组织血肿，泌尿道，胃肠道出血，月经过多，产后出血，甚至颅内出血。与HA患者不同的是很少关节出血与畸形，特点为出血程度并不与抗体滴度相关。临床过程可在数月内缓解，也可持续数年，死亡率高达22%。
[实验室检查]
一．筛选试验  APTT延长且不能被正常血浆纠正， FⅧ：C随孵育时间呈进行性下降。
二．FVIII抑制物定量(Bethesda法)  该方法并不能完全中和自身抗体，测定剩余FⅧ活性，因此测定的抗体滴度往往比实际上低。在孵育过程中由于PH的影响，可能存在非抗体因素灭活FVIII，导致假阳性，建议采用Nijmegen改良法：将患者血浆与缓冲后的正常人血浆共同温育以保证体系pH稳定，并将缓冲后的正常血浆与乏FⅧ血浆做对照，提高准确性，适合低滴度抗体的检测。非HA患者由于血浆中有一定量的残存FVIII，故难以准确测定非HA血浆中的抗体。
  [治疗方案及原则]
应根据抗体的滴度；患者的免疫反应类型；出血程度及FVIII浓度给予个体化治疗。
  一．伴有抑制物HA的治疗原则：迅速止血+去除抗体.
（二）止血   
1．低反应型（抗体滴度<5BU），无严重出血患者
（1）如FⅧ:C大于5%，可先用DDAVP 0.3- 0.4ug/kg/次。
（2） 如无效用大剂量FⅧ浓缩物40-100u/kg/d，q12h 或开始150u/kg/2-3次，随
后1000u/h持续静滴，一般足以中和循环中的抑制物, 达到止血目的。或采用rFⅧ，100U/kg，随后10U/（kg.h）持续静脉滴注或猪FⅧ0-100U/kg, 随后4U/(kg.h) 持续静脉滴注。
2．高反应型（抗体滴度>5BU-30 BU） 输注FⅧ后刺激抑制物的产生，治疗较困难。
（1）小的出血：立即给“旁路途经”药物如PCC/APCC 75u-100u/kg，qd或Bid。50%可达止血效果。应避免长期，反复使用，以免血栓形成。如无效，可血浆置换，静脉输注丙球（IVIG），利用蛋白A层析柱体外吸附抗体。
（2）严重的或威胁生命的出血：
提高血浆因子浓度：去除抗体+及/或大剂量FⅧ
大剂量FⅧ浓缩物70-140u/kg 或40u/kg/BU；或开始10000u，然后1000u/h维持。
猪FⅧ浓缩物50-100U/kg, 8-12h；或4U/(kg.h) 持续静脉滴注。（猪FVIII抗体滴度<5BU时方可用）。副作用：血小板减少，抗人，抗猪FVIII产生。
如抗体滴度仍高，血浆置换以暂时去除抗体，随后再输入大量FVIII 4U/(kg.h) 持续静脉滴注及新鲜冰冻血浆。
当人或猪的FVIII用量过大，血浆置换仍无效,有威胁生命的出血时，用“旁路制剂“PCC 50-100u/kg或APCC 50-70U/kg, q8-12h，止血效果达40-50%。仍无效，选用另一种“旁路制剂“重组FVIIa（rFVII）70-100ug/kg , q2-4h (短效), 静脉注射，70%-80%有效。
(三) 去除抗体：诱导免疫耐受
1．血浆置换  用于抗体滴度高伴严重出血，且输注FVIII后不足以止血者。每次置换4-6L血浆可使抗体下降60-90%。血浆置换后需再输入大量FVIII及新鲜冰冻血浆。
2．体外吸附 利用蛋白A层析柱选择性吸附IgG (除Ig3) 所有亚型的FC碎片，抗体可由数千降至数十BU，但不适合急性出血。
3．免疫疗法 单独用免疫抑制剂对HA伴抑制物效果差，对非HA 患者的自身免疫抗体效果好。
4．免疫耐受（ITI） Brackman最早（1977年）成功的将免疫耐受疗法用于FVIII抑制物的治疗，其机理为通过反复暴露于抗原使患者产生免疫耐受，抑制FVIII抗体的产生。方案为每天给超大剂量的FVIII（200Ukg-1，合用或不用免疫抑制剂），数月到数年建立免疫耐受。但也有学者采用较小剂量（25-50 Ukg-1），隔日给药的方案也成功地获得免疫耐受。 “国际免疫耐受登记处”（IITR）推荐最有效方案为：输注FVIII 100u/（kg.d），对60%-80%伴抑制物的患者有效。联合免疫抑制剂可加速免疫耐受产生，降低费用。但目前多数方案单用FVIII，以避免免疫抑制剂的副作用，且免疫抑制剂在遗传性HA抑制物治疗中的疗效从未被认可。rituximab（CD20）治疗难治性抑制物有待进一步研究。大剂量静脉输注丙球（IVIG）+CTX，或加免疫吸附可有协同作用。获得缓解的中位时间为37个月。有关选用高剂量还是低剂量，高纯度还是低纯度FVIII以及开始与维持时间仍存在争议。免疫耐受不适合轻，中度出血，非急症，选择性手术伴抑制物患者的治疗。免疫耐受降低抑制物的机制尚未完全清楚，但已证实并非通过阻止FVIII抑制物的产生，可能是诱导机体产生抗独特性抗体（中和抑制物的抗体）的产生，并发现治疗有效的患者体内产生了这种抗体。
5．静脉输注丙球（IVIG）：免疫球蛋白中的特异抗体可灭活FVIII抗体，具有长短期的免疫抑制效果，剂量0.4g/（kg.d）X5d，需与其他药物联合应用，不宜首选。
[ 展望]
自身特异性调节将成为诱导长期免疫耐受的新方法。利用类似抗FVIII独特型抗体或多肽进行主动免疫，产生中和抑制物或活性的抗独特性抗体。另一种方法是通过阻断不依赖抗原的B细胞和T细胞之间的相互作用，干扰依赖T细胞的B细胞的激活。采用单克隆抗体CD40-CD40L，通过阻断CD40-CD40L途径抑制FVIII抗体的产生，已应用于3例伴高滴度抗体HA患者的治疗。另一种有效的方法是研制模仿能被VIII因子的抑制物识别的抗原决定簇的分子，起“抑制抑制物”的作用。
二．获得性FVIII抑制物治疗
1．治疗原发病，如SLE。约1/3病例的抗体可自发性消失。
2．迅速止血+清除抗体（参考HA抑制物治疗）
（1）免疫抑制剂对非HA伴自身免疫抑制物有较好的疗效，达50%。首选强的松 1-1.5mg/kg/d。如无效，可改用或加用细胞毒药物：环磷酰胺1-2mg/（kg.d）口服；硫唑嘌呤2mg/(kg.d)口服。如抗体持续存在，可换环孢菌素A，2-5mg/（kg.d）。也有联合α干扰素的报告，免疫抑制治疗一般疗程3-6周，如6-12周仍无反应，应终止。
（2）严重活动性出血：参照HA产生抑制物者。
八．基因治疗：是根治血友病的唯一方法。由于血友病是单基因突变引起；血浆中凝血因子只需轻微提高（5%）就足以使重型血友病患者出血症状明显改善；凝血因子可在多种体细胞中表达，因此成为最适合基因治疗的遗传性疾病中疾病之一。其原理为利用载体（病毒，非病毒）将正常基因导入患者体细胞进行功能表达，纠正遗传性基因缺陷，以持久产生可达止血需要的正常凝血因子。目前主要采用的策略：将携带正常FVIII/FIX的基因直接应用于人体（in vivo）或将在体外经基因改造可表达FVIII/FIX的细胞种植回人体内（ ex vivo）。基因治疗能否成功的关键因素：
目的基因（FVIII/FIX）的改造  去除FVIIIcDNA中无活性B区，长度减少70%，易包装入一般载体中，FVIII表达水平增加5-10倍。人工突变A2区抑制序列中的ATATTT重复序列，提高FVIII分子转录水平。基因转导载体 理想载体应该是无毒，无抗原性，易于大量制备，能有效的将目的基因导入特定的靶细胞长期稳定的表达。载体的选择与构建是血友病基因治疗中的关键问题。病毒载体转导效率高应用较多，缺陷性重组逆转录病毒（MoMLV）：制备简单，可感染多种细胞，免疫原性低。缺点：只能感染分裂期细胞；可整合到宿主细胞引起插入突变（联合免疫缺陷患儿发生白血病），安全性令人担心。慢病毒载体：可在细胞分裂期通过核孔主动转运到细胞核中。缺点：靶细胞少；较强的致病原性（HIV发展的逆转录病毒）。腺病毒栽体可载入较大的基因片段，同时携带多个目的基因拷贝。缺点：表达时间短（感染后附着体形式存在，不整合；产生抗病毒抗体）。重组腺相关病毒（rAAV）：无致病性；可感染多种非分裂期的体细胞故目前应用较多。缺点：包装能力小于FVIII基因，可通过轻重链分别导入或改造FVIII基因（去除B区）解决。非病毒载体：脂质体，多聚体，多肽等安全，制备简单，无免疫反应。缺点：转导率低，表达时间短未能广泛应用。靶细胞的选择 是影响FVIII/FIX表达的重要因素。肝细胞，自体纤维母细胞，骨髓基质细胞，造血干细胞均可选用。
国外自80年代起，已在血友病动物（鼠和狗）模型中成功的进行了持续表达。最近国际上5个血友病基因转导研究组已在36例重型血友病（A或B）患者体内成功的进行了因子的表达，初步结果令人鼓舞。
Avigen（剂量递增安全性试验）9血友病B 患者经肌肉注射携带FIX cDNA的腺相关病毒载体（AAV2），其中3例 FIX有所升高（最高达3.7%）。
Chiron试验：13血友病A经外周血静脉注射携带无B区的FVIII cDNA逆转录病毒载体（辅助抗白血病病毒载体），其中6例FVIII提高到1%-6%, 表达持续时间最长为250天，出血程度减轻，替代治疗次数减少。由于2例患者精液中检测到少量转基因而终止。
Therapies试验：利用电穿孔技术将无B区的FVIII cDNA质粒转染到血友病A患者自体纤维母细胞，经体外培养后通过腹腔镜植回中网膜。3/6例患者FVIII1%，最高达4%。但12个月后6例患者FIII均降至治疗前水平，且均感染了HCV，其中4人同时感染HIV。
GenStar试验：3例血友病A患者静脉注射携带无B区的人FVIII cDNA和白蛋白启动子
的腺病毒（IV）载体，虽应用较大剂量病毒载体时FVIII在肝脏中有所表达（1%），但由于全身副作用（转氨酶升高，严重血小板减少）以及精液中检测到转基因而终止。
Avigeng试验：将含有1个FIX基因，抗胰蛋白酶启动子的重组的AAV2载体，非手术导入6例血友病患者肝动脉，循环中FIX水平达3%-12%维持2-3周，6周后降至1%以下。副作用：转氨酶升高9倍。
建立新基因传递方法：将慢病毒（类似HIV但无病毒复制能力）载体插入CD34干细胞，利用自体内皮细胞作为基因转移的靶细胞。
未来设想：修复RNA；利用基因改造（携带正常FVIII基因）循环中的内皮细胞祖细胞作为FVIII合成的来源；直接修饰基因，修复单个硷基突变 ；基因改造的干细胞治疗。
由于目前存在如下问题，血友病基因治疗尚处临床试验阶段： 载体的安全性：目前已报道病毒感染的可能性；生殖细胞潜在致突变传递给子代的危险性；插入性突变致白血病作用，通过改用腺病毒，腺相关病毒和其他载体，重新设计插入的基因和启动子，采用新的基因传递系统已得到部分解决。外源基因表达的水平及稳定性：病毒只能插入分裂期的细胞；插入的基因不表达或低水平（5%）表达凝血因子，且维持时间短，患者仍不能摆脱对替代治疗依赖。
九．预防：美国血友病基金会医学专家委员会（MASAC）推荐对无关节损坏的重型血友病儿童定期预防输注 FVIII 20-40U/kg/次，tiw，FIX 25-40U/kg/次biw，保持因子水平在0.01 IU/dl 以上，使重型血友病变成中或轻型。早期出血只需较小剂量即可止血，如果关节损伤后才开始预防治疗，则需要更大剂量和更多次数的治疗。
十 家庭治疗：国外已广泛开展，除3岁以下婴幼儿和病情较重者外，均可在家中由患者本人或家属输注浓缩物，其目的是使患者一旦出血，及早接受替代治疗，防止出血进一步加重。家庭治疗也可作为预防治疗，降低关节病变及致残率。
十一 遗传学控制：血友病是性联隐性遗传性疾病，因此检出携带者和对高危胎儿进行产前诊断以降低患儿的出生，对于优生优育，提高人口素质具有深远的社会意义。
血友病B (Christmas综合征)
 发生率为1/60 000新生儿，约占血友病总数的20-25%。FIX基因位于Xq27，全长34kb，有8个外显子和7个内含子。已发现有600多种基因突变。
 [治疗] 原则同血友病A。
（一）凝血酶原复合物（PCC）/激活的凝血酶原复合物（APCC）：参照血友病A一节。
血栓危险性与剂量、时间有关，应避免超大剂量和长期使用。
（二）FIX浓缩物：每输注1U可使FIX水平提高1%，半寿期为24小时。可用于HB和FIX抑制物免疫耐受的治疗。用法：所需FIX剂量=体重（kg）X 所需提高因子浓度。

（三）高度纯化的FIX浓缩物：几乎无II,VII,X，无血栓副作用。现已用于发达国家HB的治疗,手术或严重出血的加强治疗，或有血栓史或严重肝功损害的HB患者的治疗。
（四）重组的FIX浓缩物（rFIX）1997年获FDA批准使用，无病毒感染危险。推荐剂量：rFIX用量=体重（kg）X预计提高值（%）X 1.2。
（五）基因治疗：利用质粒或病毒载体将正常人FIX基因的cDNA导入体细胞中表达。我国复旦大学于1991年在国际上首次报告了两例HB的基因治疗，利用逆转录病毒载体将正常人FIX基因的cDNA转入HB患者的皮肤成纤维细胞中并获成功表达。
（六）FIX抑制物：重型HB接受FIX浓缩物治疗后产生，发生率约2%-4%,。大的基因缺失或重排是产生抑制物的高危因素。自发性抑制物少见：可发生在自身免疫性疾病，如SLE，分娩后，或无原因。治疗。定量采用改良的Bethesda方法，抗体迅速抑制FIX，而抗FVIII抗体呈时间依赖性。治疗原则同FVIII抑制物: 低滴度可用大剂量FIX浓缩物；高滴度可用大剂量PCC或APCC和rFVIIa。30%-40%HB免疫耐受治疗（大剂量IVIG+环磷酰胺+FIX制剂）获成功。也有利用葡萄球菌蛋白A免疫吸附抗体获成功的报道。